آنزیم های پی سی آر , بایو ری ایجنت , PCR ENZYMES , BIOREAGENTS

   صفحه اصلی   |   درباره ما   |   مقالات   |   محصولات   |   تماس با ما

ژن کلونينگ

ژن کلونينگ فرآيندي است که طي آن توالي مشخصي از DNA را جداسازي مي‌کنند تا نسخه‌هاي يکساني از آن را در محيط طبيعي ( سلول يا بافت زنده ) بدست آورند.

هدف از ژن کلونينگ فراهم کردن نسخه‌هاي متعدد از يک ژن منفرد است. تکثير يک ژن در حوزه‌هاي مختلف تحقيقاتي مورد استفاده است. به علاوه داراي کاربردهاي پزشکي از قبيل ژن درماني و کاربردهاي صنعتي نظير توليد مقدار زيادي از يک پروتئين مي‌باشد.

براي کلون کردن ژن قطعه‌اي از DNA را از موجودي به موجود ديگر منتقل مي‌کنند. سلولي را که منشا DNA از آن است را « دهنده » و سلولي را که آن را دريافت مي‌کند « ميزبان» مي‌گويند.


کلونينگ ژن به روش‌هاي مختلفي صورت مي‌گيرد اما اساس همه‌ي آنها به اين صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج مي‌شود و با کمک آنزيم‌هايي برش داده مي‌شود و به داخل يک مولکول DNA حلقوي، که معمولاً يک پلاسميد است و نقش ناقل ( وکتور ) را دارد، وارد مي‌شود. به اين ترتيب يک مولکول DNA نوترکيب ساخته مي‌شود. در مرحله‌ي بعد DNA نوترکيب را به سلول ميزبان که اغلب نوعي باکتري مي‌باشد منتقل مي‌کنند. اين مرحله را ترنسفورماسيون مي‌نامند. DNA نوترکيب در سلول ميزبان همانندسازي مي‌کند و همراه سلول ميزبان تکثير مي‌شود. سلول‌هاي حاصل از تقسيم سلول ميزبان اوليه، نسخه‌هايي از DNA نوترکيب همانندسازي شده را به ارث مي‌برند. سلول‌هاي باکتري به دنبال تقسيمات متعدد کلني تشکيل مي‌دهند و از آنجا که اعضاي اين کلوني حاوي يک يا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکيب حمل مي‌شود مي‌باشد، مي‌توان گفت اين ژن کلون شده است.

استخراج و برش ـ اولين گام در توليد DNA نوترکيب و سپس کلون کردن آن، استخراج و برش وکتور از سلول باکتري و DNA از سلول دهنده مي‌باشد.

براي استخراج DNA از سلول دهنده، ابتدا بايد «عصاره‌ي سلولي» تهيه کرد. براي اين منظور غشاي سلول را متلاشي مي‌کنند تا محتويات آن خارج شود سپس مخلوط حاصل را سانتريفيوژ مي‌کنند تا زوائد آن ته‌نشين شود و مايع رويي که «عصاره‌ي سلولي» است و حاوي DNA مي‌باشد را جمع آوري مي‌کنند. عصاره‌ي سلولي علاوه بر DNA حاوي پروتئين و RNA نيز مي‌باشد. با يکي از روش‌هاي «تجزيه‌ي آنزيمي پروتئين و RNA » يا «کروماتوگرافي تعويض يوني» DNA را از عصاره‌ي سلولي تخليص مي‌کنند.

براي استخراج پلاسميد از سلول باکتري، بعد از تخليص DNA بايد پلاسميد را از DNA کرومزوم باکتري جدا کرد. براي اين منظور از تکنيک « اولتراسانتريفيوژ » که بر مبناي شيب جرمي مي‌باشد استفاده مي‌کنند.
بعد از جداسازي، DNA سلول دهنده بايد به قطعات کوچکتر بريده شود. برش DNA به قطعات کوچکتر را مي‌توان از طرق راه‌هاي مختلفي انجام داد از آن جمله ايجاد شکست در DNA با استفادها از امواج صوتي ( سونيکيت )مي‌باشد. در اين صورت طول قطعات حاصل از يک مولکول DNA با مولکول ديگر متفاوت خواهد بود چرا که شکست مولکول DNA به صورت تصادفي صورت مي‌گيرد. کشف «آنزيم‌هاي محدود کننده» (restriction enzymes) محققان را قادر ساخت تابتوانند قطعات با طول يکسان را از چندين مولکول DNA يکسان فراهم کنند. آنزيم‌هاي محدود کننده باکتري‌ها را قادر به دفاع در مقابل فاژها مي‌کند. اين آنزيم‌ها مولکول DNA را درمحل‌هاي ويژه‌اي باترتيب نوکلوتيدي خاصي قطع مي‌کنند. بنابراين براي آنکه‌ يک مولکول DNA با اين آنزيم‌ها بريده شود، وجود توالي‌هاي خاصي به نام «جايگاه محدود کننده» در مولکول DNA ضروري است و بايد براي برش DNA به دنبال آنزيمي گشت که داراي بيش از 2 جايگاه محدود کننده بر روي آن باشد.

همچنين مزيت ديگر استفاده از آنزيم‌هاي محدود کننده اين است که مي‌توان از همان آنزيم براي برش پلاسميد ناقل استفاده کرد و به اين طرق امکان انطباق دو انتهاي قطعه‌ي ژن هدف با دو انتهاي بريده شده‌ي پلاسميد را به سادگي فراهم کرد.

 بعد از تهیه‌ و طراحی ناقل مناسب و اتصال ژن مورد نظر به آن، DNA نوترکیب باید وارد سلول زنده شود تا با استفاده از دستگاه همانندسازی موجود در سلول، ژن هدف تکثیر و بیان شود.

عمل انتقال DNA نوترکیب به سلول زنده «ترنسفورماسیون» است و موجودی که از این طرق DNA نوترکیب را دریافت می‌کند تراریخت یا ترنسژنیک(Transgenic) نام دارد.


سلول‌هایی که معمولاً به عنوان پذیرنده‌ی مولکول نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرند، باکتری‌ها هستند چراکه رشد و تکثیر در باکتری‌ها به سرعت صورت می‌گیرد و کشت‌ آنها نیز ساده‌تر و ارزان‌تر است.


اکثر گونه‌های باکتریایی توانایی جذب مولکول DNA از محیط اطرافشان را دارند.‌ DNA خارجی در باکتری اغلب تجزیه می‌شود اما در صورت داشتن جایگاه شروع همانندسازی قابل شناسایی توسط سیستم همانندسازی باکتری، می‌تواند در سلول میزبان باقی بماند و تکثیر شود.

قدرت جذب DNA خارجی برای همه‌ی باکتری‌ها به یک میزان نمی‌باشد. به عنوان مثال باکتری اشرشیاکولی، که پرکاربردترین باکتری در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی میکروبی است، در شرایط عادی قدرت جذب کمی دارد و میزان وقوع تراریختی در این شرایط مطلوب نخواهد بود. از این رو برای بهینه سازی میزان تراریختی باید باکتری را تحت تیمارهای خاصی قرار داد تا قدرت جذبش افزایش یابد.

در دهه‌ی 1970 با مشاهده‌ی اینکه سلول‌های ای.کولای خیسانده شده در محلول نمکی بسیار سرد، نسبت به سلول‌هایی که با محلول نمکی تیمار نشده اند، DNA را خیلی بهتر جذب می‌کنند، راه حل مشکل موجود در مرحله‌ی ترنسفورماسیون یافت شد. به این ترتیب که باکتری‌ها را در محلول کلرید کلسیم یا کلرید ربیدیوم با غلظت 50 میکرومولار قرار می‌دهند و سپس DNA نوترکیب را به باکتری تیمار شده می‌افزایند.

کلرید کلسیم تنها سبب اتصال DNA به دیواره‌ی باکتری می‌شود و به طور مستقیم در جذب DNA نقش ندارد. برای جذب واقعی DNA به درون سیتوپلاسم باکتری، آن را در معرض شوک حرارتی قرار می‌دهند که سبب افزایش نفوذپذیری دیواره‌ی باکتری می‌شود. حرکت DNA به درون باکتری با بالا بردن دمای انکوباتور تا 42°C تسریع می‌شود.

گام بعدی در کلونینگ ژن، شناسایی تراریخت‌ها است. از آنجا که در مرحله‌ی تولید DNA نوترکیب، تقریباً کنترلی در نحوه‌ی اتصال قطعه‌ی DNA به مولکول ناقل وجود ندارد، در پایان مرحله مخلوطی از انواع اتصال‌ها، از جمله؛ مولکول ناقل فاقد قطعه‌ی DNA ، قطعات DNA هدف متصل نشده به ناقل و مولکول‌های ناقلی که به صورت نامطلوب تولید شده اند، حاصل خواهد شد. همچنین در مرحله‌ی ترنسفرماسیون برخی سلول‌ها DNA نوترکیب را دریافت نمی‌کنند و کلونی حاصل از رشد آنها ژن مورد نظر را دربر ندارد. از این رو لازم است تا کلونی‌هایی که DNA نوترکیب مطلوب را دریافت کرده‌اند به طریقی شناسایی شوند. برای این منظور مهندسان ژنتیک، تکنیک‌های مختلف طراحی وکتورها یا ناقل‌های مورد استفاده در کلونینگ را متناسب با هدفی که در کلونینگ ژن دنبال می‌کنند، مورد استفاده قرار می‌دهند که در بخش دیگری به توضیح آن می‌پردازیم.


کلونینگ DNA کاربردهای متعددی دارد که در مجموع به آنها «مهندسی ژنتیک» گفته می‌شود که از آن جمله تعیین توالی ژنوم موجودات است که راه را برای تعیین توالی پروتئین‌های موجودات و استفاده از آن در مطالعه‌ی عملکرد پروتئین‌ها و مهندسی پروتئین می‌گشاید.

همچنین در تهیه‌ی «اثر انگشت DNA » برای تشخیص هویت، تشخیص بیماری‌های وراثتی، ژن درمانی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، ایجاد موجودات تراریخت، تولید انبوه تجاری پروتئین‌های مختلف از جمله انسولین انسانی، هورمون رشد و آنزیم‌های مورد استفاده در صنعت کاربرد دارد.



 

 

 

مشاهده کاتالوگ

 

 

طراحی و میزبانی وب سایت : سباهاست